Validating bovine sexed semen samples using quantitative PCR

Summary In cattle, separation of X‐ and Y‐bearing sperm cells by flow‐sorting technology makes it possible to predetermine the sex of calves. Due to high costs and decrease in fertilization, the extensive use of sexed semen in livestock depends heavily on sorting purity of sperm cells. Validating the accuracy of sperm sexing requires reliable procedures, therefore a real‐time polymerase chain reaction (PCR) assay was established to calculate the male cell proportion in the sexed semen based on the relationship between the amplification of a SRY fragment and an autosomal gene (MSHR) fragment. Our results showed stable amplification of SRY for 100–1 ng of genomic DNA, which allows detection of 1% of male cells if 100 ng of target DNA is used. To account for the discrepancy in the efficiency of the MSHR and the SRY amplification correction of the difference of the mean values was performed. The ratio of male to female sperm cells in unsexed semen cells was very accurately determined. The fractions of the sexed samples, however, were different from the expected range appearing lower than estimated. Thus, the study reveals that real‐time PCR provides a good basis for the examination of sexed sperm cells, but needs to be optimized for the samples. Zusammenfassung Die Auftrennung von X‐ und Y‐tragenden Rinderspermien mittels Durchflusszytometrie ermöglicht die Auswahl des Geschlechts der Kälber. Neben höheren Kosten und reduzierter Trächtigkeitsrate hängt der breite Einsatz gesextem Spermas bei landwirtschaftlichen Nutztieren von der Reinheit der Trennung ab. Deren Überprüfung verlangt ein zuverlässiges Verfahren. Deshalb wurde eine quantitative PCR erstellt, welche den Anteil männlicher Zellen aufgrund des Verhältnisses zwischen der Amplifizierung einer SRY Sequenz und einer Sequenz eines autosomalen Genes (MSHR) berechnet. Unsere Resultate zeigten eine stabile Amplifizierung von SRY auf 100 bis 1 ng genomischer DNS, was ein Nachweis von 1% männlicher Zellen ermöglicht, wenn 100 ng der Zielsequenz verwendet wird. Die Effizienz der MSHR und der SRY Amplifizierung war unterschiedlich und wurde deshalb mit der Differenz der Mittelwerte korrigiert. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Spermien in nicht‐aufgetrenntem Sperma wurde zuverlässig bestimmt. Die Verhältnisse in gesexten Spermien lagen unterhalb der erwarteten Werte. Die Untersuchung zeigt, dass die quantitative PCR eine gute Methode zur Untersuchung von gesexten Sperma ist, aber für die jeweiligen Proben optimiert werden muss.